Comenzi: 0214240504, 0734394338, 0754432971, 0771078288, Relații cu clienții: 0767287306, (inclusiv WhatsApp, SMS)
Banner logo
Calitate, pentru că meriți!
Pe acest website, comenzile se realizează fără autentificare sau înregistrare.

 

Introducere

Cancerul cervical este actualmente una dintre bolile destul de răspândite, fiind, după opinia specialiștilor în domeniul medical, a doua cauză majoră a deceselor în rândul femeilor din întreaga lume, provocând decesul a aproximativ 280000 de femei în fiecare an. 80% dintre cazurile de cancer cervical sunt în țările aflate în curs de dezvoltare și această boala este, de asemenea, a doua cauză majoră a mortalității femeilor din SUA, cu vârste cuprinse între 21-39 ani. În ciuda progreselor făcute în radioterapie și chimioterapie, problemele legate de aceste terapii, precum efectele secundare și dezvoltarea rezistenței la medicamente, au rămas nerezolvate. Între timp, rata ridicată a mortalității provocate de cancerul cervical a rămas relativ neschimbată. Una dintre strategiile folosite pentru a rezolva aceste probleme este de a găsi noi tratamente și de a le include în modalitățile curente de abordare terapeutică a cancerului cervical. În această direcție, s-a remarcat faptul că amigdalina, o substanță ce conține în mod natural acid cianhidric, dobâdește reputație ca substanță complementară pentru tratamentul cancerului, aceasta datorită eficienței sale în inhibarea creșterii celulelor canceroase și datorită disponibilității sale pe piață. Prin urmare, este de dorit studierea aprofundată a mecanismelor anticancer prezente în cazul amigdalinei,precum și aplicațiile acestei substanțe in vivo.

 

 

 

Amigdalina este o substanță ce se găsește în cantități remarcabile în sâmburii de caise, în sâmburii de migdale, în sâmburii de piersică, în sâmburii de mere și în ale plante din familia Rosaceae, și este compusă din două molecule de glucoză, o moleculă de benzaldehidă și o moleculă de acid cianhidric. Există referințe clinice despre faptul că amigdalina prezintaă un efect anticancer prin inducerea apoptozei în cazul celulelor canceroase în cancerul de prostată și scade numărul genelor aflate în legătură cu ciclul de viață al celulelor în cazul celulelor canceroase SNU-C4 din cancerul de colon la om. Se crede că benzaldehida din amigdalină este responsabilă pentru efectul analgezic al amigdalinei și ca acidul cianhidric din amigdalină este răspunzător pentru efectul anti-neoplastic al amigdalinei. Astfel, amigdalina ar putea fi o substanță nouă cu virtuți terapeutice pentru pacienții bolnavi de cancer, deși sunt anumite rețineri în ceea ce privește folosirea amigdalinei ca medicament împotriva cancerului, datorită toxicității acidului cianhidric eliberat în procesul terapeutic. Actualmente se remarcă un interes crescut pentru validarea amigdalinei ca substanță terapeutică în tratamentul cancerului. În această directie, efectul anticancer și mecanismul acțiunii amigdalinei în cazul cancerului cervical nu au fost raportate niciodată până acum. Astfel, prezentul studiu cercetează efectul apoptotic al amigdalinei in vitro si in vivo la nivelul celulelor canceroase HeLa din cancerul cervical la om, pentru a furniza argumente în favoarea utilizării amigdalinei în tratamentul cancerului cervical.

 

Materiale și metode

Reactivi

Amigdalina, Dimetil sulfoxid (DMSO), 4,6-diamino-2-fenil indol (DAPI) și triton X-100 au fost cumpărate de la Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA).

Culturile de celule

Celule canceroase din linia HeLa de cancer cervical la om și linia de celule amniotice FL embrionare umane au fost cumpărate de la Tumor Center of Chinese Academy of Medical Sciences.

Testul MTT de citotoxicitate

Acest test a fost făcut pentru a determina citotoxicitatea amigdalinei asupra celulelor HeLa si FL. Aceste tipuri de celule au fost crescute în 96 de godeuri, la o densitate de 1 × 105 celule/ml. După 12 ore s-a adăugat amigdalina cu concentrațiile de 1,25, 2,5, 5, 10 și 20 mg/ml în mediu DMEM, cu 0,2% FBS timp de 24 ore. După adăugarea a 5µl de reactiv MTT (din kit-ul MTT pentru testarea proliferării celulelor, Trevigen, SUA) în fiecare godeu, acesta a fost incubat timp de 4 ore înainte de a se adăuga 100µl de soluție DMSO pentru solubilizare. Apoi s-a măsurat absorbția la 570 nm și s-a calculat procentajul de viabilitate a celulelor.Testul a fost repetat de cel puțin trei ori.

Morfologia celulelor HeLa si FL

Celulele HeLa si FL au fost însămânțate în 96 de godeuri pentru cultură. După 12 ore a fost adăugată amigdalina în concentrații de 1,25, 2,5, 5, 10 și 20 mg/ml în mediu DMEM, conținând 0,2% FBS timp de 24 de ore. Schimbările morfologice de la nivelul celulelor au fost observate cu ajutorul unui microscop Olympus CKX41 (Olympus, Japonia).

Colorarea DAPI

Colorarea DAPI a fost folosită pentru a observa schimbările morfologice ale nucleului la celulele apoptotice. Celulele au fost analizate cu ajutorul microscopiei cu fluorescentă, folosind aparatul IX70-SIF2 Olympus.

Colorarea dublă cu anexina V-FITC și iodura de propidium

Inducția apoptozei de către amigdalină a fost evaluată prin colorarea dublă cu anexina V-FITC și cu iodura de propidium.

Testul vestic al sugativei

Acest test a fost utilizat pentru evaluarea proteinelor aflate în legătură cu apoptoza. Testul a fost repetat de cel puțin trei ori.

Testul activității enzimei Caspaza-3

Enzima Caspaza-3 este un biomarker cheie pentru apoptoză. Creșterea relativă a activității enzimei caspaza-3 a fost determinată prin compararea absorbției cromoforului p-nitroanilina (pNA) în cazul celulelor HeLa tratate cu amigdalină, cu absorbția în cazul celulelor HeLa de control, netratate.

Activitatea anticancer a amigdalinei in vivo

Pentru a evalua efectul amigdalinei asupra formării tumorii și asupra morfologiei acesteia, s-a recurs la implantarea unor cobai cu celule HeLa. Cobaii au fost cumpărați de la Beijing Vital River Experimental Animals Technology (Beijing, China). Pentru a produce tumoarea la nivelul cobailor, a fost colectată o cantitate de 5×106 celule HeLa și au fost injectate în partea dreaptă a cobailor. Atunci când mărimea tumorilor a ajuns la 30-50 mm3, cobaii au fost împărțiți aleatoriu în trei grupuri de câte 6 cobai. Cobaii din grupul de control au primit zilnic o injecție intraperitoneală cu 0,9% NaCl în volum de 0,2 ml, timp de 14 zile. Cobaii din grupul de control pozitiv au primit zilnic o injecție intraperitoneală cu 30 mg/kg 5-fluorouracil (5-FU) în volum de 0,2 ml timp de 14 zile. În grupul de tratament cu amigdalină, cobaii au primit 300 mg/kg de amigdalină în volum de 0,2 ml, timp de 14 zile. Cobaii din fiecare grup au fost cântăriți și dimensiunile tumorilor au fost măsurate la fiecare 2 zile. La o zi după ultima injecție, tumorile au fost îndepărtate cu grijă, fixate în soluție neutră de formalină 10% in bufer PBS și apoi încorporate în parafină.

Testul TUNEL

Secțiuni de 5µm grosime, obținute din țesuturile tumorale încorporate în parafină au fost folosite pentru a identifica apoptoza cu ajutorul unui kit bazat pe deoxinucleotidil transferaza terminala (dUTP). Dimensiunea apoptozei a fost evaluată prin numărarea celulelor pozitive TUNEL.

Analize statistice

Datele experimentale rezultate au fost exprimate ca valori medii și s-au constatat diferențe semnificative din punct de vedere statistic între grupurile de control și cele tratate cu amigdalină.

Rezultate

Efectul amigdalinei asupra viabilității celulelor HeLa și FL

Viabilitatea celulelor HeLa tratate cu amigdalină a scăzut proporțional cu doza de amigdalină administrată. La concentrațiile de 1,25, 2,5, 5, 10 si 20 mg/ml, viabilitatea celulelor HeLa tratate cu amigdalină a fost, respectiv, de 93,38±4,15% (p>0,05), 91,67±5,29% (p>0,05), 83,14±5,46% (p<0,01), 70,67±2,59% (p<0,001) și 48,56±2,86% (p<0,001) procente din valoarea de control. Un aspect interesant este că amigdalina nu a avut niciun efect asupra viabilității celulelor FL.

Schimbările morfologice ale celulelor HeLa tratate cu amigdalină

Concentrațiile crescute de amigdalină au condus la tendința descreșterii numărului de celule HeLa, dar nu a schimbat semnificativ numărul celulelor FL. Celulele HeLa au devenit de formă circulară după tratamentul cu amigdalină, în special la concentrații mari de amigdalină. Colorarea DAPI a celulelor HeLa tratate cu amigdalină a relevat fenomene de condensare și de fragmentare la nivelul nucleului.

Analiza apoptozei prin colorarea dublă a celulelor HeLa cu anexina V-FITC și iodura de propidium

Celulele HeLa au devenit apoptotice după ce au fost tratate cu amigdalină. Distribuția celulelor apoptotice HeLa, măsurată cu ajutorul citometriei în flux, a arătat că numărul celulelor apoptotice HeLa timpurii și târzii a fost semnificativ mai mare în comparație cu grupul de control. Mai precis, creșterea concentrației de amigdalină de la 0 la 1,25, la 2,5, la 5, la 10 și la 20 mg/ml a fost corelată cu o creștere a raportului dintre celulele HeLa apoptotice și totalul celulelor HeLa după cum urmează: 8,8±0,7%, 14,3±1,6%, 15,6±2,9%, 21,4±1,8%, 25,4±2,3% si 33,7±2,6%.

Expresia proteinelor Bcl-2 si Bax

Expresia proteinei Bax a crescut și expresia proteinei Bcl-2 a scăzut proporțional cu doza de amigdalină administrată în cazul celulelor HeLa tratate cu amigdalină. După 24 de ore de expunere la concentrații de amigdalină de 1,25, 2,5, 5, 10 si 20 mg/ml, raporturile corespunzătoare ale expresiei proteinelor Bax față de expresia proteinelor Bcl-2 au fost după cum urmează:

0,17±0,05, 0,25±0,04, 0,41±0,09, 0,68±0,1, 1,36±0,13, 1,69±0,11

Efectele amigdalinei asupra activității enzimei caspaza-3 la nivelul celulelor HeLa

Enzima casapza-3 a fost activată de amigdalină la nivelul celulelor HeLa, proporțional cu doza de amigdalină administrată. Concentrațiile crescânde de amigdalină la doze de 0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 mg/ml au condus la creșterea activității enzimei caspaza-3, după cum urmează: 0,139±0,02, 0,149±0,02, 0,164±0,01, 0,29±0,01, 0,394±0,01, 0,482±0,04. Mai mult, inhibitorul enzimei caspaza-3, DEVD-fmk, a oprit activarea enzimei caspaza-3 activată de amigdalină. La concentrația de 20 mg/ml de amigdalină, activitatea enzimei caspaza-3 la nivelul celulelor HeLa tratate cu DEVD-fmk a fost de numai 25,7% față de celulele HeLa netratate cu DEVD-fmk.

Efectele amigdalinei asupra creșterii in vivo a celulelor HeLa

Xenografturile tumorale transplantate prin intermediul celulelor HeLa au fost folosite pentru a evalua activitatea antitumorala a amigdalinei in vivo. Astfel, amigdalina a inhibat în mod semnificativ creșterea tumorii. Mărimea medie a tumorii la cobaii din grupul de control a fost de 453,2±132 mm3 la 14 zile, în urma injecției solutiei saline. În contrast, cobaii injectați cu 300 mg/kg de amigdalină sau cu 30 mg/kg 5-FU, au prezentat o tumoare cu mărimea medie de 255,4±134,8 sau 269,5±101,3 mm3. În ceea ce privește greutatea corporală, nu au fost diferențe semnificative între cele trei grupuri de cobai: cobaii de control, cobaii tratați cu 5-FU și cobaii tratați cu amigdalină. Amigdalina a inhibat creșterea tumorii prin inducerea apoptozei. Procentul celulelor pozitive TUNEL în grupurile de control (injectați cu soluție salină), 5-FU (30 mg/kg) și amigdalină (300 mg/kg) au fost, respectiv 2,1±0,7, 36,3±2,1 și 33,8±3,5.

 

Discuție

Scopul principal al studiului a fost de a testa ipoteza că amigdalina induce apoptoza în linia de celule HeLa din cancerul cervical uman, aceasta pentru a o adăuga la substanțele terapeutice folosite pentru tratarea cancerului cervical. Astfel, au fost descoperite trei lucruri esențiale: (1) viabilitatea și numărul de celule HeLa au scăzut după tratamentul cu amigdalină; (2) apoptoza indusă la nivelul celulelor HeLa este posibil să aibă loc pe calea intrinsecă a apoptozei. (3) administrarea amigdalinei in vivo a inhibat creșterea tumorii provocate de celulele HeLa printr-un mecanism de apoptoză.

Testul MTT poate determina cu acuratețe numărul de celule vii și este indispensabil pentru testarea citotoxicității, revelantă pentru screening-ul medicamentelor anti-cancer. Prin folosirea acestui test în studiul de față, s-a descoperit că amigdalina a redus viabilitatea celulelor HeLa proporțional cu doza de amigdalină administrată. Efectul amigdalinei asupra viabilității celulelor s-a dovedit a fi dependent de tipul celulei, deoarece celulele FL tratate cu amigdalină nu au prezentat schimbări semnificative în comparație cu celulele FL netratate cu amigdalină. Un fenomen similar a fost demonstrat prin observarea la microscop a celulelor cultivate. Astfel, numărul celulelor HeLa tratate cu amigdalină a fost semnificativ mai mic decât numărul celulelor HeLa de control, netratate cu amigdalină, în vreme ce numărul celulelor Fl nu a fost afectat de tratamentul cu amigdalină. Mecanismele din spatele diferenței în răspunsul celulelor HeLa și al celulelor FL la tratamentul cu amigdalină rămân ascunse deocamdată. Este cert că anumite trăsături specifice ale celulelor HeLa și ale celulelor FL contribuie la această diferențiere a lor în ceea ce privește răspunsul la tratamentul cu amigdalină. Unele studii sugerează că celulele canceroase sunt bogate în beta-glucozidaza, enzima care poate desface amigdalina pentru a elibera acid cianhidric, substanță ce își exercită toxicitatea asupra celulelor canceroase. Alte studii sugerează că rodanaza, enzima care are abilitatea de a descompune acidul cianhidric, este prezentă la nivelul țesuturilor normale, dar este deficientă la nivelul celulelor canceroase. În fapt, este foarte posibil ca acțiunea combinată a celor două  enzime menționate mai sus, beta-glucozidaza și rodanaza, să fie responsabilă pentru inducerea toxicității specifice acidului cianhidric la nivelul celulelor canceroase tratate cu amigdalină, substanță ce otrăvește și distruge celulele canceroase prin intermediul acidului cianhidric, în vreme ce celulele normale rămân neafectate. Linia de celule HeLa provine din cancerul cervical la om și celulele FL provin din celulele benigne ale amnionului embrionic uman. Sunt necesare studii ulterioare care să determine dacă beta-glucozidaza este sau nu prezentă în cantități sporite la nivelul celulelor HeLa și dacă rodanaza este sau nu prezentă în cantități sporite la nivelul celulelor FL și dacă aceste particularități sunt responsabile pentru acțiunea specifică a amigdalinei asupra proliferării celulelor HeLa, comparativ cu influența nesemnificativă a amigdalinei asupra celulelor FL.

Studiul de față a demonstrat că amigdalina a fost în stare să provoace apoptoza la nivelul celulelor HeLa. Așadar, este cel mai probabil ca reducerea viabilității celulelor HeLa tratate cu amigdalină a avut loc prin mecanismul apoptozei. Astfel, efectul apoptotic al amigdalinei asupra celulelor HeLa a fost testat cu diferite tehnici, din diferite unghiuri, incluzând colorarea DAPI și analizarea alterărilor morfologice la nivelul nucleelor celulare cu un microscop cu fluorescență. Colorarea dublă cu anexina V-FITC și cu PI a fost folosită pentru a măsura cantitatea de celule apoptotice timpurii și târzii prin citometria în flux. Activitatea enzimei caspaza-3, cunoscută pentru medierea apoptozei, și raportul dintre proteinele Bax și Bcl-2 s-au dovedit, de asemenea, a fi crescute în cazul tratamentului cu amigdalină. Rezultatele studiului demonstrează efectul apoptotic al amigdalinei asupra celulelor HeLa. Inducția apoptozei de către amigdalină și în cazul altor tipuri de celule a fost raportată recent, incluzând celulele din cancerul de prostată și din leucemia promielocitară, aspecte care concordă cu studiul de față, exceptând tipul de celule. În ceea ce privește apoptoza, există două căi care o mediază: calea extrinsecă și calea intrinsecă. Calea extrinsecă este mediată de receptorii pentru moarte. Mitocondriile joacă un rol esențial în ceea ce privește calea intrinsecă ce conduce la apoptoză, fiind regularizate de familia de proteine Bcl-2. Rezultatele prezentului studiu arată că raportul dintre proteinele Bax și proteinele Bcl-2 a crescut în cazul celulelor HeLa tratate cu amigdalină proporțional cu doza administrată, sugerând implicarea căii intrinseci în apoptoza indusă de amigdalină. În plus față de apoptoză, un alt mecanism prin care amigdalina a redus viabilitatea celulelor HeLa ar fi putut fi oprirea ciclului celular. Pentru a testa această posibilitate a implicării amigdalinei în ciclul celular, celulele HeLa tratate cu amigdalină au fost colorate și distribuția celulelor în fazele G0/G1, S si G2/M a fost măsurată prin citometria în flux. Prin acest test s-a dovedit că modul de distribuție al celulelor HeLa tratate cu amigdalină și al celulelor HeLa netratate cu amigdalină, în fazele G0/G1, S și G2/M a rămas același, fapt care arată că în reducerea viabilității celulelor HeLa tratate cu amigdalină nu a fost implicată oprirea ciclului celular. Mecanismele prin care amigdalina reduce viabilitatea unei celule ar putea varia pentru diferite tipuri de celule cu substraturi genetice diferite: viabilitatea redusă provocată de amigdalină la nivelul celulelor de cancer de colon SNU-C4 s-a dovedit a fi mediată mai degrabă de un mecanism de scădere a numărului de proteine legate de ciclul celular, decât de apoptoză.

Rezultatele prezentului studiu arată că amigdalina a inhibat în mod semnificativ creșterea tumorilor produse de linia de celule HeLa la cobai, printr-un mecanism de inducere a apoptozei. Nu s-au constatat efecte secundare semnificative la cobai după administrarea amigdalinei. Acest lucru poate fi adevărat, deoarece amigdalina este un remediu provenind din plante sau este o vitamină ce se găsește în mod natural. Deși ea conține un grup hiodrocianic, care este toxic pentru celulele vii, amigdalina este o substanță sigură atât timp cât molecula de amigdalină rămâne intactă, cu alte cuvinte, atât timp cât grupul hidrocianic nu este eliberat pe cale enzimatică din molecula de amigdalină.

 

Concluzie

Rezultatele acestui studiu demonstrează că amigdalina este capabilă să inhibe atât in vitro, cât și in vivo, dezvoltarea celulelor canceroase din linia de celule HeLa provenite din cancerul cervical la om, printr-un mecanism de inducere a apoptozei. Aceste date sugerează că amigdalina poate fi considerată o potențială substanță terapeutică, eficientă în tratamentul cancerului cervical.

 

 

Minerale coloidale, AquaNano
- ediția a treia -
Argint coloidal AquaNano Ultra, 80ppm.
Pur electrocoloidal!
Aur coloidal AquaNano Celest, 110ppm
Un produs unic!
Argint coloidal, set, AquaNano ArgiKit
Util și comod!
Capsule vegetale, 150bucăți, mărimea 0.
Pentru plante, uleiuri esențiale, extracte...

Protocol antitumoral simplu și extrem de eficient

Vă recomandăm să citiți cu atenție, și să aplicați perseverent informațiile conținute în acest articol, mai ales în cazul în care vă confruntați, dumneavoastră personal sau cineva drag, cu această afecțiune.

Am structurat aici un protocol clar și eficient, ale cărui efecte sunt excepționale atunci când este aplicat perseverent, și mai ales în stadii incipiente.

Totodată, el poate fi completat cu diferite alte adjuvante, uzual fără probleme semnificative, și poate fi utilizat în paralel cu chimioterapia sau radioterapia, caz în care efectele secundare ale acestor tratamente vor fi semnificativ reduse.

Citește mai departe...

T-Stop
un remediu antitumoral de excepție
ArgiDent
Pastă de dinți naturală, foarte eficientă, pentru persoane sensibile
Gel de Aloe Vera
Pur, natural, din culturi organice
Aur coloidal
Vital Pur, Olympus - tinerețea sufletului tău
Argint coloidal Protect, Forte
Protecție, prevenire, vindecare
Deodorante naturale cu argint coloidal
Deovis, te păstrează curat în mod delicat
Helia, Sativa, Delis
Creme naturale cu argint și aur coloidal
Magneziu, calciu, potasiu, fier, cupru, mangan, zinc
Minerale organice, pure, fără aditivi
ArgiMax, argint coloidal 1000ppm
Acțiune puternică, decisivă, rapidă
Virgo, Tytan, Coral
Săpunuri lichide 100% naturale, cu argint și aur coloidal
ArgO2, inamicul bacteriilor și mucegaiurilor
Puterea combinată a argintului și oxigenului
Vitamina C naturală
normală sau alcalină
Uleiuri esențiale naturale
Sănătate și încântare

Copyright

AghorasBio, AquaNano, Mellixir,

Electrik, Auris, AloeDirect,

CannExtract, FlorEsențial, BioMineral,

sunt mărci comerciale Aghoras Invent.

 

Copyright  S.C Aghoras Invent  S.R.L

Plătiți în siguranță

logoPO
Puteți efectua plățile online, prin intermediul cardului de debit/credit, sau din contul dumneavoastră PayPal.

Contactați-ne oricând

Comenzi:
Vodafone - 0734394338
Orange - 0754432971
Telekom - 0214240504
RDS - 0771078288
Program: Luni-Vineri, 8-15
 
Relații cu clienții, comenzi:
Telekom - 0767287306
WhatsApp, SMS - 0767287306
Program: Luni-Duminică, 8-22
 
Această adresă de email este protejată contra spambots. Trebuie să activați JavaScript pentru a o vedea.